高级探针滑动窗口设计器 (Python)
标准引物探针设计软件（如 Primer3）底层内置了严格的长度上限（通常探针最大长度限制在 35bp 左右），无法直接满足特殊实验场景下对 超长探针（如 80-100bp） 的设计需求。
本项目提供了一套完全独立的自动化解决方案。通过基于 Python 的“滑动窗口”切片技术与动态惩罚打分系统（Penalty System），本工具能够突破传统软件的限制，在海量基因组序列中极速筛选出具备完美热力学与生物化学性质的长探针。
- 突破长度限制：支持在任意指定的长度区间（如 80-100bp）内穷举提取探针。
- 智能 C/G 翻转机制：自动统计 C 和 G 的比例。当 G 含量 > C 含量时（会降低 PCR 反应效率），程序会自动将其转化为反向互补链，变废为宝。
- 绝对规避 5'G 淬灭：内置一票否决机制，强制剔除所有 5' 端为 G 的探针，从根源上杜绝荧光淬灭。
- 动态 Tm 与二级结构罚分：针对目标 Tm 值进行动态加权罚分，同时自动扫描并惩罚连续的 GC 富含区（如连续 5 个 G 或 C），避免复杂的空间折叠。
- 高性能与断点续传：支持多进程并行加速（Multiprocessing），并自带断点续传（Checkpoint）与进度条功能。应对千万级探针筛选毫无压力。
本脚本基于 Python 3 编写。在运行前，请确保安装了以下依赖库：
pip install pandas biopython tqdm只需指定输入的 FASTA 序列文件和输出的 CSV 结果文件，程序将以默认参数运行：
Bash
python probe_designer.py -i input.fa -o best_probes.csv如果您的目标 FASTA 文件非常大，建议调大滑动步长（-s）以大幅减少计算量，并限制输出数量（-n）：
Bash
python probe_designer.py -i input.fa -o best_probes.csv -s 10 -t 69.5 -n 1000 -p 8| 参数 | 缩写 | 默认值 | 描述 |
|---|---|---|---|
--input |
-i |
必填 | 输入的 FASTA 序列文件路径。 |
--output |
-o |
必填 | 输出的 CSV 结果文件路径。 |
--step |
-s |
1 |
滑动窗口的步长。调大该值（如设置为 5 或 10）可显著提升运行速度。 |
--tm |
-t |
69.0 |
探针的理想目标 Tm 值。程序将以此为中心进行动态罚分。 |
--top_n |
-n |
0 (输出全部) |
最终输出得分最高（罚分最低）的前 N 条探针。 |
--threads |
-p |
自动识别 | 开启的进程数。默认使用系统所有可用 CPU 核心并行计算。 |
程序运行完成后，会生成一个按 总罚分（Penalty_Score）升序排序 的 CSV 文件。排在越前面的探针，越符合理想的实验条件。
输出表格包含以下关键列：
Probe_Sequence: 最终的探针序列。Is_Reverse_Complement: 是否触发了 C/G 智能翻转（Yes/No）。Tm: 基于最近邻算法 (NN) 计算的 Tm 值。Penalty_Score: 综合罚分。得分越接近 0 越完美。
程序运行时会自动在输出目录下生成同名的 .log 日志文件，详细记录参数和处理过程。同时会生成 .processed.txt 记录处理进度。若程序意外中断，重新运行相同命令将自动跳过已处理的序列。